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蛋白表達純化有關天然蛋白質的三個關鍵參數

更新時間:2020-11-12點擊次數:1309
   對重組蛋白表達的常見問題是真核蛋白在細菌中表達時傾向于不溶。變性、聚集和/或截短形式的蛋白形成不可溶的包涵體,需要進一步純化和重折疊,這可能是低效的和不*的。
  與天然蛋白質表達的三個關鍵參數:
  1.IPTG濃度
  有可能宿主中的蛋白表達將通過lac操縱子系統操作。這個系統的詳細解釋可以在別處找到,加入異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),一種乳糖類似物,控制蛋白的表達。蛋白的表達應處于生長的對數期,即當溶液的波長600(OD 600)處的光密度達到0.4-0.6。如果目標是可溶性蛋白質,不要改變細胞中蛋白的折疊功能。已經假定不溶性蛋白可能是由于分子伴侶的存在。因此,使用高濃度的IPTG(>1mM)可能不總是產生好的結果。嘗試幾個不同的濃度,看看哪一個給高的可溶性蛋白的產量。
  2.溫度
  偶爾可以在37℃的典型溫度下,通過生長和誘導分離可溶性形式的蛋白質,但通常情況下,溶解度在較低溫度下增強。可嘗試在30℃,25℃和18℃下進行誘導。
  注意:如果首先在37℃生長,先讓培養物冷卻到誘導溫度,再加入IPTG。
  3.誘導時間
  更長并不總是更好。對于對宿主有毒的蛋白尤其如此。在誘導期間,每隔幾個小時取樣,并檢查目的蛋白的表達。典型的誘導時間根據溫度而變化,對于37℃,嘗試4小時;對于30℃,進行5-6小時,并且任何低于25℃的溫度應該允許生長過夜。
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